細(xì)胞的來源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。若能穩(wěn)定生長傳10~20代以上的細(xì)胞可確立為細(xì)胞系。若有條件能開展單細(xì)胞克隆、純化，經(jīng)大量擴增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細(xì)胞群，稱之為細(xì)胞株或克隆細(xì)胞。此過程稱為細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和掌握其他方法,本章重點敘述常用的基本技術(shù)。   

*節(jié) 原代細(xì)胞的取材   

人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的要條件，是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的*步，若取材不當(dāng)，將會直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)，現(xiàn)將取材的基本要求和注意事項敘述如下：   

一、取材的基本要求   

（1）取材要注意新鮮和保鮮 新鮮組織易于培養(yǎng)成功，取材時應(yīng)盡量在4~6h內(nèi)能制作成細(xì)胞，盡快入箱培養(yǎng)，若不能即時培養(yǎng)，應(yīng)將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，于4℃存放。若組織塊較大，應(yīng)在清除表面壞死組織、脂肪和結(jié)締組織后，切碎于培養(yǎng)液內(nèi)4℃存放，但時間不能超過24h。對于已切碎的組織或血液、淋巴組織應(yīng)加入含10%二甲基亞砜的培養(yǎng)基，按細(xì)胞凍存方式于液氮中冷凍保存。   

（2）取材應(yīng)嚴(yán)格無菌 所取標(biāo)本材料應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，為了確保無菌，對所取材料若疑有污染的可能，應(yīng)將所取組織在含高濃度抗菌素（400單位/mL）甚加入適量的兩性霉素B或10%達(dá)克寧液的培養(yǎng)液內(nèi)于4℃下存放2小時以上，再用PBS洗2~3次，以確保所取材料無菌。要用無菌包裝的器皿或事先消毒好的帶少許培養(yǎng)液（內(nèi)含400單位/mL抗菌素）的小瓶等便于攜帶的物品來取材，所取材料應(yīng)避免接觸有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，如碘、汞等。   

（3）取材和原代細(xì)胞制作時，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細(xì)胞的機械損傷。   

（4）要仔細(xì)去除所取材料上的血液、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。   

（5）取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。   

（6）原代細(xì)胞取材時要同時留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。對組織的來源、部位、包括供體的一般情況要做詳細(xì)的記錄，以備以后查詢。   

二、各類組織的取材技術(shù)   

(一) 皮膚和粘膜的取材   

皮膚和粘膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要組織來源，主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2~4cm2即可，這樣局部*痕，若對燒傷皮膚進(jìn)行上皮細(xì)胞膜片移植，可從大腿或臀部取較大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材時不要用碘酒消毒；若培養(yǎng)上皮細(xì)胞，取材時不要切取太厚，盡可能去除所攜帶的皮下或粘膜下組織；若欲培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，則反之。皮膚粘膜與外界相通部位，因表面細(xì)菌、霉菌很多，取材時應(yīng)嚴(yán)格消毒，必要時要用高濃度抗菌素和適量兩性霉素B漂洗、浸泡。   

(二)內(nèi)臟和實體瘤的取材   

內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織，否則培養(yǎng)后，由于成纖維細(xì)胞的生長給以后的培養(yǎng)工作增加困難。對于一些特殊細(xì)胞培養(yǎng)的取材，詳見后面有關(guān)章節(jié)。   

(三)血液細(xì)胞的取材   

血液及淋巴組織中的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時應(yīng)注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素濃度為8~10u/mL血，抽血的針筒也要用肝素濕潤，若從血站取來的獻(xiàn)血員的血液，因血站不用肝素抗凝劑，常用含枸椽酸鹽抗凝，對此類血標(biāo)本千萬不能用含鈣、鎂離子的洗液來處理細(xì)胞，因此時的鈣、鎂離子可加速血液中凝血酶促進(jìn)血液凝固而影響收獲血細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。此外要嚴(yán)格無菌，盡量新鮮使用。   

(四)骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材   

取上述標(biāo)本時，除嚴(yán)格無菌，注意抗凝外，還要盡快分離培養(yǎng)，一般無需其他處理，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。具體操作詳見后面有關(guān)章節(jié)。   

(五)動物組織取材   

1、鼠胚組織取材   

先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。   

2、幼鼠胚腎（或肺）取材   

幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。   

(六)人胚體組織取材   

在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒，無菌法取人胚肺（腎），方法與鼠類相同。   

(七)雞（鴨）鳥類胚胎組織取材   

取孵化適當(dāng)胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干，經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼，再用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚，再用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。   

第二節(jié) 原代細(xì)胞的分離和制作   

人或動物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來，常采用的方法如下：   

一、懸浮細(xì)胞的分離方法   

組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，zui簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長離心時間，但速度不能太高，延時也不能太長，以避免擠壓或機械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因為，經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。   

二、實體組織材料的分離方法    

對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。   

（一）機械分散法   

所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。   

（二）消化分離法   

組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。   

1、酶消化分離法   
        酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：   

（1） 胰蛋白酶分散技術(shù)    

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。   

①細(xì)胞類型 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織,如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效，但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。   

②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過測定而有效，但配制時必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時的pH和溫度都要適宜，否則會影響活力，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，zui終使用活力為1:200或1:250，56℃pH8.0時活力zui強。   

該酶為粉劑，保藏時要防潮，室內(nèi)溫度不宜過高，保存時間不能太長，若粉劑結(jié)團(tuán)塊,說明該部分受潮或失效。   

③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時，濃度可適當(dāng)提高，消化時間適當(dāng)延長。濃度高對細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。   

④溫度 一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時活性zui強，但由于對細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。   

⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分散快，細(xì)胞也容易被消化下來，消化分離細(xì)胞時PH只能選用7.6～8.0之間，否則對細(xì)胞有損傷。   

⑥無機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時應(yīng)采用無鈣鎂離子的PBS配制。   

⑦消化時間 如果細(xì)胞消化時間過長，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時間為20分鐘為宜，冷消化時使用低濃度消化液，于4℃過夜也可。   

分離方法如下：   

①過夜冷消化 將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。   

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：   

熱消化多次提取——將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未*消化的組織按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞。   

冷消化多次提取——方法同上，只是消化溫度為4℃。   

先熱消化后冷消化——將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下過夜，次日再提取細(xì)胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。   

（2） 膠原酶（Collagenase）消化法    

膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率，zui終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用緩和，無需機械振蕩，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。   

經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被*消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個上皮細(xì)胞更易生長，因此不必要再進(jìn)一步消化處理。   
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性（見表4-1）和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時間（小時）有差異（見表4-2），以及兩者價格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時還可加透明質(zhì)酸酶（對細(xì)胞表面糖基有作用），采用兩者的聯(lián)合消化作用，對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。   

表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別   

項 目                               胰蛋白酶                          膠原酶   
消化特性                         適用于消化軟組織              適用于消化纖維多的組織   
用 量                             0.01%～0.5%                  0.1～0.3mg/mL(200u/mL)   
消化時間                            0.5～2小時（小塊）               1～12小時   
pH                                    8～9                            6.5～7.0   
作用強度                               強烈                                緩和   
細(xì)胞影響                          時間過長有影響                     無大影響   
血清、鈣、鎂離子                     有影響                           無影響   

表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時所需時間(小時)(0.5～1cm3) 

酶 種 類                           較 硬 組 織                       軟 組 織   
                                  4℃ 室 溫 37℃                   4℃ 室 溫 37℃   
胰蛋白酶(0.25%)                  24～48 1～6 1～2                 12～24 1～2 0.5～1   
膠原酶(200u/mL)                   24   6   6.5                     12   3   0.25   
兩者聯(lián)合                 12～46 12～24 4～12                12～24 6～12 1～2   

除上述兩種zui常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。   

2、非酶消化法（EDTA消化法）   

EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離，缺點是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。   

消化分離法的操作步驟：   

（1）剪切 把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。   

（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。   

（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。   

（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。   

（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗2-3次后，加入*培養(yǎng)基。   

（6）機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。   

注意事項如下：   

（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。   

（2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。   

（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。    

三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法   

原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的*步，是一項基本技術(shù)。原代細(xì)胞因剛從組織中分離開，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也zui接近和反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細(xì)胞分化等實驗研究。   

原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類型（上皮樣或成纖維樣），但細(xì)胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個體差異也照樣存在，原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定，如需做較為嚴(yán)格的對比性實驗研究，還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng)。   

1、組織塊培養(yǎng)法   

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法：為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長，方法簡便，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁24小時后細(xì)胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長成肉眼可以觀察到的生長暈，5~7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周圍延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實驗研究。  

其培養(yǎng)方法如下：   

(1)按照前述方法取材，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。   

(2)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培養(yǎng)瓶(底面積為17.5cm2)可接種20～30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37℃溫箱內(nèi)。   

(3)培養(yǎng)2~4小時，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴(yán)禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時后再補液，培養(yǎng)初期移動和觀察時要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動，以利貼壁和生長，培養(yǎng)3~5天時可換液，一方面補充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。   
原代細(xì)胞培養(yǎng)－2   

2.消化培養(yǎng)法   

該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。   

某些特殊類型細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。   

3.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法   

對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。   

4.器官培養(yǎng)   

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對器官組織的生長變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細(xì)胞間的、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。
1. 器官培養(yǎng)的特殊的要求   

(1)需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng)，其營養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來供給，因此，培養(yǎng)時為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營養(yǎng)而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過1mm。   

(2)器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：   

a. 將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。   

b. 提高培養(yǎng)基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時仍需保持5% CO2，以維持pH。   

2. 器官培養(yǎng)的方法   

(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中，高度為1/2皿高，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。   

(2)將培養(yǎng)基加入平皿中，使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。   

(3)將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過200μm，水平面積不超過10mm2，如為肝、腎不能大于1mm2。   

(4)將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓達(dá)90%，培養(yǎng)時注意使液面與膜保持在一致的水平上。   

(5)上述器官培養(yǎng)1~3周（每隔2~3天換液一次）后可用于實驗和檢測。     

第三節(jié) 原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持   

一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持   

(一)原代細(xì)胞培養(yǎng)   

1、靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))   

凡經(jīng)消化液處理實體組織來源的細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性，細(xì)胞接種時濃度要稍大一些，少為5×108細(xì)胞/L，培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)，小牛血清濃度為10%～80%，有條件的應(yīng)在37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。若原代貼壁細(xì)胞不是用于長期培養(yǎng)，只是用于分離繁殖或測定病毒之用，其細(xì)胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利病毒的效價提高和測定結(jié)果（如空斑）更加明顯、準(zhǔn)確，待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，此時的pH若有明顯變化，應(yīng)將原代細(xì)胞換液，即倒去舊液，換入新鮮的培養(yǎng)基，以便除去衰老、死亡的細(xì)胞和陳舊的培養(yǎng)基，使貼壁細(xì)胞能獲得充足的營養(yǎng)。   
若用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時，可有少量的肌樣纖維間質(zhì)細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞開始貼壁生長，為了利于該貼壁細(xì)胞充分貼壁和生長，此時換液應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后，按半量換液方式棄去舊液加入新液，然后再將細(xì)胞懸液放入原瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)幾次換液后，貼壁肌樣細(xì)胞逐漸形成網(wǎng)狀，此時換液可將原懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基移入另一新瓶，然后分別補加新鮮培養(yǎng)基(也按半量換液方式分別對半加入新液)繼續(xù)培養(yǎng)，原瓶的貼壁細(xì)胞逐漸長成單層，而新瓶中又會出現(xiàn)二次貼壁細(xì)胞，經(jīng)幾次換液也會逐漸長成單層，在此類細(xì)胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中往往需加入少量的維生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（濃度要在20%以上），以利細(xì)胞貼壁生長。   

2、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)   

凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓的淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及白血病細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細(xì)胞。若作用于試驗的短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞濃度可在5～8×109/L范圍內(nèi)，然后進(jìn)行分瓶試驗。若要將淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞進(jìn)行長期培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長，待細(xì)胞開始增殖甚結(jié)成小團(tuán)塊，培養(yǎng)基中pH變酸，說明細(xì)胞生長繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時盡量使細(xì)胞不丟失），待細(xì)胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時，此時可考慮傳代。但千萬不能急于傳代，一定要待細(xì)胞密度較高時才能進(jìn)行，以防傳代失敗。  

(二)原代細(xì)胞的維持   

1、貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的換液）   

貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時，由于營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，不適宜細(xì)胞生長，此時細(xì)胞還未長成單層，未達(dá)到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量*培養(yǎng)基。若希望細(xì)胞能在較長時間內(nèi)能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。   

2、懸浮細(xì)胞   

凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮生長而不貼壁的細(xì)胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞的短期培養(yǎng)無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細(xì)胞不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細(xì)胞不適宜生長，需進(jìn)行換液。白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞體外長期培養(yǎng)時，都需換液培養(yǎng)，待達(dá)到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。 

半量換液的方法如下：   

將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內(nèi)，若細(xì)胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮*培養(yǎng)基。若細(xì)胞不能沉于瓶底，可吸出細(xì)胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮*培養(yǎng)基，混勻后再轉(zhuǎn)入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。   

二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的傳代   

原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚達(dá)飽和密度，貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳5～10代以內(nèi)的細(xì)胞通常稱為次代培養(yǎng)細(xì)胞，傳10~20代以上的細(xì)胞，通常確定為傳代細(xì)胞（或稱傳代細(xì)胞系）。然而，傳代細(xì)胞系的建立，關(guān)鍵是初代培養(yǎng)的傳代。 

應(yīng)注意如下幾點：   

(1)細(xì)胞生長密度不高時，或未能達(dá)到覆蓋整個瓶底時不能急于傳代。   

(2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞多為混雜細(xì)胞，形態(tài)各異，往往是上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存，采用胰蛋白酶消化時要掌握好消化時間，因成纖維細(xì)胞易于脫壁，上皮細(xì)胞不易脫壁，因此，可根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)南瘯r間及時中止消化。在早先傳代時，其消化時間比一般已建系的細(xì)胞相對長一些。   
(3)吹打已消化的細(xì)胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對細(xì)胞的機械損傷。   

(4)傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，以利于細(xì)胞的生存和繁殖。如果消化分離的細(xì)胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養(yǎng)瓶，盡量減少細(xì)胞損失。   

(5)傳代培養(yǎng)時的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當(dāng)加大15%～20%左右。   

三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)   

原代細(xì)胞經(jīng)傳代后所形成的傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進(jìn)行細(xì)胞傳代。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代，部分貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代。后兩種傳代方法比較簡單，唯有貼壁細(xì)胞的消化傳代法比較復(fù)雜一些。 

現(xiàn)將具體方法介紹如下：   

(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。   

(2)每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。   

(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2～3分鐘，輕輕搖動，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時應(yīng)立即終止消化。   

(4)加入*培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機械損傷。   

(5)用計數(shù)板計數(shù)，計算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。   

四、傳代細(xì)胞的建系和維持   

細(xì)胞系的維持是培養(yǎng)工作的重要內(nèi)容，是通過換液傳代再換液、再傳代和細(xì)胞種子凍存來實現(xiàn)的，但對每一個細(xì)胞系來說都有其自身的特點，要做好建系的維持須注意以下幾點：   

1.細(xì)胞檔案   

細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時間、擴增時間(分裂指數(shù))，細(xì)胞的特殊遺傳標(biāo)志(標(biāo)記染色體)等，這些記錄對于保證細(xì)胞的正常生長，保持細(xì)胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細(xì)胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。   

2.換液傳代   

(1)細(xì)胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長特性的改變，給以后的實驗帶來影響。   

(2)多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉，甚每個細(xì)胞系均需單獨實驗室，傳代時各系均分開單獨操作，每傳5代后，細(xì)胞種子均應(yīng)凍存。傳代時均應(yīng)作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標(biāo)記，標(biāo)記細(xì)胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時間。若細(xì)胞生長較快，可減去換液程序，每次均可傳代。每個傳代細(xì)胞系，能分成2～3條線，分別傳代，同時也可在適溫或4℃短期存放一瓶，以防止污染丟失。細(xì)胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細(xì)胞變異，此外還可提供不同代次的細(xì)胞同時進(jìn)行對比試驗。   

3.細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理   

當(dāng)一個細(xì)胞系（或株）建立后，專家鑒定可有可無，按慣例，只要認(rèn)真研究，記錄完整，資料和結(jié)果確切，就可在有關(guān)雜志上或刊物上報道細(xì)胞的各次實驗指標(biāo)。   

下面為美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫或細(xì)胞銀行（ATCC）入庫細(xì)胞的基本要求：   

（1）培養(yǎng)簡歷 組織來源日期、物種、組織來源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)，細(xì)胞已傳代數(shù)等。   

（2）凍存液 培養(yǎng)基和保護(hù)劑名稱。   

（3）細(xì)胞活力 凍融前后細(xì)胞接種存活率和生長特性(生長繁殖曲線，分裂指數(shù)等)。   

（4）培養(yǎng)液 培養(yǎng)基種類和名稱、血清來源及濃度。   

（5）細(xì)胞形態(tài) 類型，如上皮或成纖維細(xì)胞等。   

（6）核型 二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體有或無。   

（7）無污染情況 包括細(xì)胞、真菌、支原體、原蟲和病毒等。   

（8）物種檢測 檢測同功酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有無交叉污染。   

（9）免疫檢測 一兩種血清學(xué)檢測。   

（10）細(xì)胞建立者 建立者姓名、檢測者姓名。    

第四節(jié) 細(xì)胞的純化和克隆   

體外培養(yǎng)的細(xì)胞源于人或動物體內(nèi)或胚胎組織，其體內(nèi)的細(xì)胞都是混雜生長，每一種組織都有血管和間葉組織，因此，來源于上述組織的培養(yǎng)材料的原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長，即有上皮樣細(xì)胞，又有纖維樣細(xì)胞，纖維樣細(xì)胞又包括成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等，混雜的細(xì)胞會直接影響實驗結(jié)果，而利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實驗研究時，為了保證實驗結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實驗，這樣才能對某一細(xì)胞的功能、形態(tài)等變化進(jìn)行一系列研究，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實驗研究的重要一步，甚需要從混雜的細(xì)胞群中分離出單個細(xì)胞來進(jìn)行培養(yǎng)和開展實驗研究。   

一、細(xì)胞的純化   

細(xì)胞的純化一般分為兩種，即自然純化和人工純化。可根據(jù)不同細(xì)胞種類、來源、實驗要求和目的選擇采用。   

(一)自然純化   

自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細(xì)胞，靠自然增殖的潛力，zui后留下生長優(yōu)勢旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無法按照需要和實驗要求及目的來選擇細(xì)胞，此法花費時間長，留下來的往往是成纖維細(xì)胞。僅有那些惡性變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過此方法而保留下來，不斷純化而建立細(xì)胞系。   

(二)人工純化   

人工純化，即利用人為手段造成某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。   

1、細(xì)胞因子依賴純化法   

人和動物組織中某些細(xì)胞需要有特殊的細(xì)胞因子存在的微環(huán)境才能長期存活和生長繁殖，如IL-2是T細(xì)胞生長所必需的細(xì)胞因子，BCGF是B細(xì)胞的生長因子，體外培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞若加入IL-2就可使T細(xì)胞生長繁殖，形成IL-2依賴的T細(xì)胞系，如CTLL-2細(xì)胞株，而其他細(xì)胞則自然被淘汰，采用此法還建立了IL-6依賴的細(xì)胞系，如B9、CTD7細(xì)胞株。   

2、酶消化法   

酶消化法是比較常用的純化方法，不僅對貼壁細(xì)胞可行，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開，達(dá)到純化的目的，對貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。   

（1）上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化   

兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時間才脫壁，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開。 

方法如下：   

①采用常規(guī)消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)兩次，每次加1mL（25mL培養(yǎng)瓶）來回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過所有細(xì)胞表面，然后倒掉。   

②蓋好瓶塞（或蓋），將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓，部分脫落，立即加入2mL有血清的培養(yǎng)液終止消化。   

③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長的區(qū)域（可事先在鏡下用記號筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號）。吹打時不要用力，也不要吹打上皮細(xì)胞生長區(qū)域。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液于瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次，隔幾日后或下次傳代時，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過幾次處理，就可將成纖維細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_。   

（2）骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化   

在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長，但也有許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞粘附其上，種類混雜，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開和純化的目的。 

其方法如下：   

①待基質(zhì)或肌樣細(xì)胞基本形成單層時，倒去舊液，加入無鈣、鎂PBS漂洗，并用力搖動后倒掉，反復(fù)洗2~3次后，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附細(xì)胞被洗掉，但仍留有不少粘附細(xì)胞。   

②將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶1mL（25mL培養(yǎng)瓶），輕輕搖動讓胰蛋白酶流過細(xì)胞表面，作用1~2分鐘后再輕輕搖動1~2次后倒去。   

③蓋好瓶蓋，在普通顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)或肌樣細(xì)胞由于貼壁較牢固未脫壁，而原先粘附的細(xì)胞已浮起，此時再加2mL PBS洗一次倒掉，盡量除去粘附細(xì)胞。   

④加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，再繼續(xù)用力搖動后倒掉，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。隔幾日或下次傳代前，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過幾次處理和傳代培養(yǎng)后就可將粘附細(xì)胞去除，將兩者分開，達(dá)到使骨髓基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞純化的目的。   

3、機械刮除法   

原代培養(yǎng)時,如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上?？刹捎脵C械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域。

其方法如下：   

(1)將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行。   

(2)用硅橡皮刮子在不需要生長的細(xì)胞區(qū)域推劃，使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細(xì)胞。   

(3)推劃后用培養(yǎng)液沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。   

(4)數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長出，可再進(jìn)行上述操作，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。操作過程中要嚴(yán)格無菌操作，防止污染。   

4、反復(fù)貼壁法   

成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過程快，大部分細(xì)胞能在短時間內(nèi)（大約10~30min）完成附著過程（但不一定*伸展），而上皮細(xì)胞（大部分）在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。 

其方法如下：   

(1)將細(xì)胞懸液接種在一個培養(yǎng)瓶內(nèi)（培養(yǎng)液內(nèi)不含血清，此時上皮細(xì)胞貼壁更慢）靜置20分鐘。   

(2)在倒置顯微鏡下觀察，見部分細(xì)胞貼壁，稍加搖動也不浮起時，將細(xì)胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min，然后再重復(fù)上述操作后，即可將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分隔開，在第1瓶和第2瓶以成纖維細(xì)胞為主，往后幾瓶即以上皮細(xì)胞為主，下次傳代時再按上述方法處理，就可使兩者達(dá)到*分開的目的。   

5、電烙篩選法   

在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，往往在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化灶區(qū)域細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長趨勢，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，此時即可用機械刮除法去除未轉(zhuǎn)化細(xì)胞，也可用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。 

其方法如下：   

(1)倒去舊液，并用記號筆劃出轉(zhuǎn)化灶的區(qū)域。   

(2)用加熱的微型電烙器(類似焊接用的電烙鐵)將轉(zhuǎn)化灶周邊的細(xì)胞全部燙死，只保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。在單細(xì)胞克隆篩選時，也可用此法將單個細(xì)胞周圍的細(xì)胞殺死，然后在適應(yīng)性培養(yǎng)基中（50%是舊液）繼續(xù)培養(yǎng)，即可達(dá)到純化的目的。   

二、細(xì)胞的克隆化   

        細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株。它們當(dāng)中每個細(xì)胞的遺傳特征和生物學(xué)特性極為相似和一致，有利于對不同群體細(xì)胞的形態(tài)和功能進(jìn)行比較和研究。若該細(xì)胞株只是一般傳代、無一系列實驗鑒定指標(biāo)，則為一般細(xì)胞株。若有一系列實驗指標(biāo)報道的，則稱為限定性細(xì)胞株，如由幼地鼠腎細(xì)胞系（BHK21）第13孔的單個細(xì)胞形成的細(xì)胞株稱BHK-21C-13（代表克隆13），其形態(tài)規(guī)則，特性穩(wěn)定，便于研究。   

        單一細(xì)胞體外培養(yǎng)能否生長繁殖zui后形成克隆，這與各細(xì)胞克隆形成率有關(guān)，如果細(xì)胞克隆形成率偏低（小于10%）應(yīng)采用一些措施，如改用胎牛血清，適應(yīng)性培養(yǎng)基添加刺激因子（如胰島素、地塞米松、細(xì)胞生長因子等），調(diào)節(jié)CO2濃度以控制pH。若貼壁效果差可選用適當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性底物（如膠原層或血漿纖維蛋白層），以及制備底層的飼養(yǎng)細(xì)胞。用X線或60Co照射處理的細(xì)胞層，如雞胚細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞，該細(xì)胞照光后只有代謝功能，無增殖和傳代能力，或選用短壽的細(xì)胞，常選用鼠腹水巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞，用于單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的克隆化。 

具體克隆方法如下：   

1.毛細(xì)管法：   

將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋1個細(xì)胞/mL，取10mL稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為0.5mm，長為8mm的毛細(xì)玻璃管若干（30～50只），在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中，在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個克隆的細(xì)胞群體。   

2.有限稀釋法   

有限稀釋法采用梯變倍數(shù)稀釋的原則，將稀釋的細(xì)胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板中（也可在板上的96孔中直接稀釋）培養(yǎng)一定時間后，孔中可出現(xiàn)單個細(xì)胞克隆，本法不需特殊設(shè)備，操作簡單快速，適合大批量克隆化培養(yǎng)?，F(xiàn)已廣泛用于異質(zhì)性細(xì)胞系的克隆化培養(yǎng)、誘導(dǎo)和分離耐藥性或高轉(zhuǎn)移性、或突變細(xì)胞株以及單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的克隆篩選中。 

具體方法如下：   

（1）取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺盼藍(lán)染色計數(shù)，測定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)高于90%以上）。   

（2）將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋50個細(xì)胞/mL、10個細(xì)胞/mL、5個細(xì)胞/mL，將3種稀釋度的細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔為0.1mL，于37℃ 5%CO2下培養(yǎng)。   

（3）次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并補加0.1mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。   

（4）培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)，待長孔底面的1/3～1/2時，可用消化法將96孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移24孔板中進(jìn)行擴大培養(yǎng)。  

3.平皿克隆分離法   
        在平皿內(nèi)將單個細(xì)胞形成克隆并進(jìn)行分離培養(yǎng)的方法如下：   

(1)將對數(shù)生長期細(xì)胞制備單個細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散，貼壁細(xì)胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）。   

(2)將上述細(xì)胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1周或更長。若有明顯的克隆形成時方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種：   

①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況， 標(biāo)記單個克隆周邊，吸干培養(yǎng)基，用涂有少量無菌硅脂的無菌金屬套環(huán)，套住標(biāo)記的克隆，在套環(huán)內(nèi)滴加少量0.25%胰蛋白酶，待細(xì)胞脫離時，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉(zhuǎn)入小平皿或24孔板或6孔板中擴大培養(yǎng)。   

②玻片法：在接種細(xì)胞懸液前，預(yù)先在60mm平皿中放入無菌小玻片，加入細(xì)胞懸液，培養(yǎng)一定時間后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記上含一個克隆的玻片，然后用無菌鑷子取出標(biāo)記玻片轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。   

4.軟瓊脂克隆分離法   

本法僅適用于懸浮培養(yǎng)的類淋巴細(xì)胞或惡性程度高的貼壁細(xì)胞，而正常貼壁細(xì)胞在軟瓊脂中不能形成克隆。   

（1）將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單個細(xì)胞懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成單個細(xì)胞)作活細(xì)胞計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度1×106細(xì)胞/L，然后根據(jù)實驗要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×104個細(xì)胞/L為佳。   

（2）制備底層瓊脂 取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂*溶化，取出一份5%瓊脂，移入小燒杯中，待冷50℃，迅速加入9份預(yù)溫37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5%瓊脂），混勻后立即注入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。   

（3）制備上層瓊脂 取37℃保溫的、不同濃度的細(xì)胞懸液9.4mL，移入小燒杯中，加入50℃ 5% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。   

（4）于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長，若需培養(yǎng)更長時間可補加0.8mL/孔含瓊脂的培養(yǎng)液，待有明顯集落形成為止。   

（5）集落（克隆）計數(shù)：在倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)直徑大于75μm或含有50個細(xì)胞以上的克隆。  

5．單細(xì)胞顯微操作法   

借助顯微操縱器，在顯微鏡監(jiān)控下將單個細(xì)胞逐個吸出，移入含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。本法準(zhǔn)確性好，如無顯微操縱器可自制毛細(xì)吸管替代。

方法如下：   

（1）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備 單個細(xì)胞在極低密度下生長非常緩慢，甚難以分裂，為了促進(jìn)克隆細(xì)胞的生長繁殖，常采用飼養(yǎng)層細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞種類和制備方法依實驗要求而定，現(xiàn)以3T3小鼠纖維細(xì)胞為例：   

①用0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長的3T3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為108細(xì)胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL細(xì)胞懸液于37℃ 5% CO2中培養(yǎng)單層。   

(2)制備單個細(xì)胞懸液 方法同上。   

(3)分離單個細(xì)胞 其方法多樣，可根據(jù)實驗條件決定：   

①毛細(xì)管吸入法 同上述毛細(xì)管法，在顯微鏡下將只有一個細(xì)胞的毛細(xì)管取出。   

②微滴法 將經(jīng)稀釋103個細(xì)胞/L的單個細(xì)胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個細(xì)胞的液滴，再用毛細(xì)管取出單個細(xì)胞懸滴。   

③液體石蠟法 將經(jīng)稀釋103個細(xì)胞/L的單個細(xì)胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加入充滿無菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個細(xì)胞液滴，仔細(xì)用毛細(xì)吸管取出有一個細(xì)胞的液滴。   

④玻璃小球附著法 將稀釋103個細(xì)胞/L的細(xì)胞懸液加入表面涂有無菌凡士林石蠟的小玻璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個細(xì)胞的玻珠，仔細(xì)用鑷子取出。   

(4)將采用上述方法分離出的單個細(xì)胞，放入預(yù)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長。   

(5)待細(xì)胞克隆明顯，并使孔底覆蓋1/3～1/2時，即可將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔板進(jìn)行擴大培養(yǎng)（貼壁細(xì)胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉(zhuǎn)種）。