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你知道WB實(shí)驗(yàn)操作步驟有哪幾步嗎?

 更新時(shí)間:2023-09-22 點(diǎn)擊量:1081

蛋白質(zhì)印跡(Western blotting):又稱為免疫印跡,根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合,半定量檢測(cè)樣品中的某種蛋白的方法?;驹硎峭ㄟ^特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析條帶的位置和條帶深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況。那么你知道WB實(shí)驗(yàn)操作步驟有哪幾步嗎?讓我們一起來看看吧!

一、樣本制備蛋白提取

1.前期準(zhǔn)備:首先要了解你所研究蛋白的內(nèi)源表達(dá)水平,常用的數(shù)據(jù)庫(kù)如Uniport、Atlas、BioGPS,或查閱相關(guān)文獻(xiàn)。設(shè)置陽性對(duì)照,選擇內(nèi)參蛋白。

2.蛋白提?。菏荳estern Blotting 的第一步,要求選擇樣本新鮮,降低背景,避免反復(fù)凍融,選擇合適的裂解液裂解樣本,選擇合適的蛋白酶或磷酸酶抑制劑,防止蛋白的降解和磷酸化信號(hào)的丟失。

二、蛋白濃度測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的方法包括Lowry法、Bradford法、BCA法,常用的是BCA法,基本原理是在堿性條件下,蛋白將Cu+ +還原為Cu+,Cu+ 與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物,測(cè)定其在562nm處的吸收值,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比,即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。

之后加入Loading buffer,含有變性劑,使蛋白質(zhì)變性,釋放二硫鍵,最后煮沸變性保存樣品于-20℃或-80℃。

三、上樣和電泳

1. 制備凝膠:根據(jù)蛋白分子量的大小,選擇合適濃度的分離膠,配膠的APS需要在4℃的冰箱中保存。配膠的試劑中,APS與TEMED是促凝劑,所以在加促凝劑之前,需先把其他組分混勻。

2.上樣:蛋白Marker孔加入5-10μL,多選擇生物素化蛋白Marker,其余蛋白總上樣量20-50μg,組織樣本稍多些上樣,盡量保持每個(gè)泳道的上樣量一致,空泳道用Loading buffer補(bǔ)齊。

3. 電泳:接上電源后,先用80V恒壓電泳濃縮至溴酚藍(lán)指示劑到濃縮膠與分離膠交界處,成線狀,改為恒壓100v--120v直至溴酚藍(lán)電泳到凝膠底部,此過程約用時(shí)1.5h。

四、轉(zhuǎn)膜

1.膜的選擇:廣泛使用的是NC膜和PVDF膜

2.轉(zhuǎn)膜:轉(zhuǎn)膜的方法包括濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)、干轉(zhuǎn),濕轉(zhuǎn)是轉(zhuǎn)膜最完quan且應(yīng)用zui廣泛的方法,但是所需時(shí)間較長(zhǎng)。

五、封閉和抗體孵育

1.封閉:目的是為了減少膜對(duì)一二抗的非特異吸附,降低背景。將NC膜從濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)中取出,并用TBST潤(rùn)洗2次,每次5 min,然后進(jìn)行封閉。

化學(xué)發(fā)光法:用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡NC膜,室溫?fù)u床封閉1-2h;

熒光法:含5% 脫脂奶粉的TBS,脫脂奶粉需選擇實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的。

最后再用TBST潤(rùn)洗封閉后的NC膜3次,每次5 min。

2.抗體孵育:一抗能識(shí)別膜上不同種屬的蛋白,買經(jīng)過驗(yàn)證的,二抗上帶有發(fā)光底物,只能識(shí)別一抗。

六、顯色曝光

常用的是化學(xué)發(fā)光,抗體上偶聯(lián)的HRP催化ECL發(fā)光底物顯色,取出洗滌的膜后,用濾紙吸干水分,放置于成像儀上,均勻滴加ECL工作液,排出氣泡,開始曝光。

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