Elabscience®自主研發(fā)的 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit，可用于檢測(cè)懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的凋亡。Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸 (PS) 有高度親和力。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被熒光染料 FITC 標(biāo)記的Annexin V結(jié)合，可通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜喪失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可與雙鏈 DNA 特異性結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，與 Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。本試劑盒檢測(cè)喜樹堿誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡效果如下圖所示：

實(shí)驗(yàn)操作：

一步法

1．細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，300 ×g 離心 5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS 洗滌一次，輕輕重 懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2．取 1~5 × 105 重懸的細(xì)胞，300 ×g 離心5 min，棄上清。用 PBS 洗滌細(xì)胞一次，離心后棄上清，加入500 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer 重懸細(xì)胞。

3．細(xì)胞懸液中加入5μL的Annexin V-FITC Reagent和5μL的PI Reagent (50μg/mL)。

4． 輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育 15~20 min。

5． 立即上機(jī)檢測(cè)。如不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)于冰上避光靜置并于1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

注：流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)Annexin V-FITC可用FITC通道，PI優(yōu)先選擇 PerCP/Cy5.5 通道，其次是ECD通道。

兩步法

1．細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，300×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS 洗滌一次，輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2．取1~5 × 10⁵重懸的細(xì)胞，300 ×g離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞一次，離心后棄上清，加入100 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞。

3．細(xì)胞懸液中加入2.5 μL的Annexin V-FITC Reagent和2.5μL的PI Reagent (50μg/mL)。（由于兩步法 分辨率更高，染色液用量減半依然可得到媲美一步法的效果；用戶亦可根據(jù)自己的模型進(jìn)行滴定后加入適量的染色液，用更少的量獲得高質(zhì)量的結(jié)果。）

4．輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15~20 min。

5．加入400 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer，混勻樣本。

6．立即上機(jī)檢測(cè)。如不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)于冰上避光靜置并于 1 小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

注：流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)Annexin V-FITC可用FITC通道，PI 優(yōu)先選擇 PerCP/Cy5.5 通道，其次是ECD通道。

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