在上篇MLPA試驗原理中，我們已經(jīng)詳細(xì)介紹了MLPA技術(shù)。MLPA，即多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測基因的拷貝數(shù)變異和序列變異。它結(jié)合了PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）和連接酶技術(shù)，通過設(shè)計特定的探針來識別和擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列。下面讓我們一起來看看MLPA的試驗步驟吧！

MLPA試驗步驟分為六步：變性、雜交、連接、PCR擴(kuò)增、片段分離、數(shù)據(jù)分析。

一、變性

將DNA標(biāo)本放入PCR儀中加熱5分鐘，使DNA雙鏈解鏈成單鏈。純化的樣本DNA被變性。

二、雜交

加入雜交反應(yīng)液。雜交反應(yīng)液包含SALSA MLPA探針混合液和SALSA MLPA緩沖液。每組MLPA探針混合物包含多達(dá)60對不同的MLPA探針，每個探針識別一個特異的靶序列。MLPA探針由兩部分組成:左探針和右探針寡核苷酸(LPO和RPO)。LPO和RPO包含PCR引物和DNA雜交序列。在MLPA反應(yīng)中，左探針寡核苷酸（LPO）和右探針寡核苷酸（RPO）都與靶序列進(jìn)行雜交。

三、連接

實驗第二天，加入連接酶反應(yīng)液。反應(yīng)液包括連接酶緩沖液A，連接酶緩沖液B和SALSA連接酶Ligase-65。連接酶Ligase-65結(jié)合到與靶序列雜交的左側(cè)探針和右側(cè)探針上，催化產(chǎn)生一個共價鍵。隨后，通過加熱反應(yīng)液使連接酶失活，從而終止連接步驟。連接酶Ligase-65特異性非常高，只要雜交區(qū)域有一個核苷酸錯配，連接酶就不會連接兩段探針，使連接反應(yīng)具有高度特異性。正是由于這種高特異性，MLPA也可以用于區(qū)分序列高度相似的假基因，以及檢測特定的點突變。

四、PCR擴(kuò)增

加入PCR聚合酶混合液。PCR聚合酶混合液包含SALSA PCR聚合酶及SALSA PCR引物混合液。PCR引物混合液中包含dNTPs、正向引物和反向引物。正向PCR引物帶有熒光標(biāo)記。所有連接上的MLPA探針均使用這對PCR引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)包含變性、引物復(fù)性以及引物延伸，循環(huán)35次。熒光標(biāo)記被帶入到MLPA擴(kuò)增產(chǎn)物，即MLPA擴(kuò)增子中。

五、片段分離

擴(kuò)增后，用毛細(xì)管電泳分離片段。毛細(xì)管電泳根據(jù)片段的長度進(jìn)行分離，并將不同長度的片段顯示為峰值模式，稱為電泳圖。

六、數(shù)據(jù)分析

每個探針上的填充序列不同，每個擴(kuò)增子都有不同的已知大小，因此在數(shù)據(jù)分析過程中可以對每個擴(kuò)增子進(jìn)行量化。毛細(xì)管電泳得到的數(shù)據(jù)將作為分析的輸入，輸入數(shù)據(jù)分析軟件Coffalyser。通過將每個樣本與一組參考樣本進(jìn)行比較，我們可以得到一個探針比，這個探針比率將告訴我們一個基因有多少個拷貝數(shù)。由于大多數(shù)人類基因是二倍體，如果樣本有兩個拷貝，比例將為1.0，即樣本探針獲得的基因數(shù)量與參考樣本相同。如果比值為0.5，則該基因在個體中只有一個拷貝，這可能意味著目標(biāo)基因的雜合缺失。另一方面，如果這個比率是1.5，那么很可能存在一個基因的雜合復(fù)制。